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研究结核杆菌耐药分子机理 的重要目 的之 一是 建立 一套快速鉴定结核杆菌耐药基因类型 的方法,解结核病患者 的耐药状况,指导临床 的化疗与防止耐药菌体 的播散. 理论上,耐药基因 的分析不需培养结核杆菌,因此与传统结核杆菌药敏试验相比有诸多优点,包括检测时间从数周与数月缩短为几天;实现自动化;降低实验室生物危险性. 耐药检测包括pcr扩增基因组内携带耐药性区域,然后扩增产物 的突变分析,应用于结核杆菌耐药基因突变分析 的技术较为成熟有直接测序法,单链构象多态性分析(sscp)及固相杂交法. 【关注焦点:医院医生和供货商都患了抗生素“依赖症”】
3 结核杆菌耐药基因 的检测方法 【健康导读:防脑卒中需服阿司匹林】
3.2 聚合酶链反应-单链构象多态性分析(prc-sscp) pcr-sscp是 检测单碱基置换与数碱基缺失或者插入 的可靠而简便方法,比直接dna测序容易进行,而广泛用作 一种突变筛选方法. 原理是 单链核酸通过自身互补或者分子内 的相互作用形成折叠构象,单个核苷酸 的突变可造成其构象改变,从而导致其[在]非变性凝胶电泳上迁移速度 的改变. telenti等采用pcr-sscp分析122株结核杆菌rpob基因中央区域157bp片段,66株耐药菌株中64株有突变. 56株敏感株没有突变. 结果显示pcr-sscp能检出单个碱基突变,可作为检测rfp耐药株 的快速筛选方法. 作者用荧光素标记pcr扩增产物而建立自动化sscp分析法,可直接检测痰涂片阳性标本与bactec阳性培养物中 的rfp耐药菌株. 采用该技术,平均每天可检测40份标本,因此适用于很多标本 的快速筛选. 作者采用自动化pcr-sscp技术对来自mdrtb暴发流行中分离 的结核杆菌耐药性进行分析,pcr-sscp检测inh耐药性 的灵敏度为87%,katg,inha,katg-inha,abpc与katg-abpc 的突变率分别为36.8%,31.6%,2.6%,13.2%与2.6%. 说明自动化pcr-sscp是 很多标本或者多个靶基因分析 的最佳方法. 【扩展阅读:避孕常识：可导致怀孕的避孕误区！】
3.1 直接测序法 耐药区域pcr扩增,prc扩增产物纯化或者克隆化取dna片段直接测序,与标准敏感菌株 的同 一dna片段比较,分析碱基突变 的位置与分布. 直接测序法是 鉴定突变 的黄金标准,但该操作繁琐,费用昂贵限制它 的广泛应用. kapur等应用自动化dna测序法分析128株临床分离 的结核杆菌rpob基因69bp区域 的突变特征,证实90%以上rfp耐药株rpob基因有碱基改变,而且多数为错义突变. altamirano等对9株异烟肼耐药株及1株敏感株进行研究,通过dna直接测序证实有8例(89%)存[在]突变,突变包括点突变,1bp 的缺失与3bp以内 的插入. 指出katg基因突变[在]inh耐药中占着比较重要地位.
3.3 固相杂交法 探针杂交法是 检测耐药基因突变 的另 一种快速简便筛选方法. debeenhouwer等根据结核杆菌rfp耐药ropb基因突变资料,设计 一组覆盖69bpropb高变区 的寡核苷酸探针,包括结核杆菌探针 一个,覆盖69bpropb高度区 的野生型探针5个,ropb突变特异 的探针4个. 依次固定于尼龙膜上,然后与待测菌株ropb基因扩增片段进行杂交,根据杂交谱带判断有无突变及突变 的类型. 因采用多个探针且固定于尼龙膜上形成多列,作者称此方法为多列探针检测法(lineprobeassay,lipa). 该方法可快速鉴定结核杆菌rfp耐药株ropb基因 的突变,适合于临床标本 的直接检测. 现已有商品化lipa试剂盒,该试剂盒检测配药物敏感试验结果 的符合率为90.2%.
参照文献
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